Kryo - Holzspalter Co., Ltd

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 3961 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Phycobilisomen (PBS) sind die wichtigsten Lichtsammelkomplexe der Photosynthese in Cyanobakterien und Rotalgen. CpcL-PBS ist eine Art kleines PBS in Cyanobakterien, das Energie ohne die Kernstruktur direkt auf das Photosystem I überträgt. Hier berichten wir über die Kryo-EM-Struktur des CpcL-PBS aus dem Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 mit 2,6-Å-Auflösung. Die Struktur zeigt die CpcD-Domäne von Ferredoxin: NADP+-Oxidoreduktase befindet sich am distalen Ende von CpcL-PBS und ist für dessen Bindung an PBS verantwortlich. Mit dem Nachweis ultraschneller transienter Absorption und Fluoreszenzspektroskopie wird die Rolle einzelner Biline bei der Energieübertragung aufgeklärt. Das in der Nähe des Photosystems I gelegene Bilin 1Iβ822 weist eine erhöhte Planarität auf und ist das rote Bilin, das für die direkte Energieübertragung zum Photosystem I verantwortlich ist.

Die Cyanobakterien gehören zu den ersten Organismengruppen, die Sonnenenergie in chemische Energie umwandeln1,2. Sie sind die ersten Organismen, die einen linearen Elektronentransfer mit zwei Photosystemen, Photosystem II (PSII) und Photosystem I (PSI), erzeugten und vor mehr als 2,4 Milliarden Jahren für den Anstieg des Sauerstoffgehalts auf der Erde verantwortlich waren1,2,3. Die wichtigsten Lichtsammelantennen zur Erfassung von Sonnenenergie in Cyanobakterien und Rotalgen sind Phycobilisomen (PBS)4,5,6,7, die die absorbierte Lichtenergie entweder an PSII oder PSI übertragen, um den Elektronentransfer voranzutreiben. PBS besteht aus Phycobiliproteinen (PBP), die kovalent gebundene Pigmente, sogenannte Biline, und Linkerproteine aufweisen4,8. In Cyanobakterien gibt es zwei Arten von PBS: CpcG-PBS und CpcL-PBS. CpcG-PBS besteht aus zwei Teilen: einem Kern und peripheren Stäben, die über die Linkerproteine CpcG mit dem Kern verbunden sind. Kürzlich ermittelte Kryo-EM-PBS-Strukturen aus Rotalgen9,10 und Cyanobakterien11,12,13 zeigten, wie Linkerproteine und PBP in hochgeordneten Lichtsammelarchitekturen organisiert sind. Das CpcL-PBS hat eine viel kleinere Größe und besteht nur aus einem Stab ohne Allophycocyanin-Kern14,15,16. CpcL-PBS, das über das Linkerprotein CpcL (in Synechocystis 6803 auch CpcG2 und in Anabaena 712017 CpcG3 genannt) an Thylakoidmembranen gebunden ist, ist mit PSI18 assoziiert und in der Lage, absorbierte Lichtenergie auf PSI zu übertragen16,19. CpcL-PBS ist auch an der Bildung des Superkomplexes NAD(P)H-Dehydrogenase (NDH)-CpcL-PBS-PSI (NDH-PBS-PSI) für den zyklischen Elektronentransfer (CEF)20 beteiligt, und eine aktuelle Studie zeigt, dass die Bindung Für CEF21 ist die Konzentration von Ferredoxin-NADP+-Oxidoreduktase (FNR) an CpcL-PBS erforderlich. Die meisten Cyanobakterien-FNR enthalten drei Domänen: CpcD-Domäne, FAD-Bindungsdomäne und NADPH-Bindungsdomäne, und der Drei-Domänen-FNR (FNR3D) ist an die peripheren Stäbchen der Cyanobakterien CpcG-PBS und CpcL-PBS gebunden22,23,24. Die Bindung von FNR3D an die PBS-Stäbe wurde jedoch in den kürzlich bestimmten Kryo-EM-Strukturen CpcG-PBS11,12,13 nicht beobachtet. Um den Mechanismus der direkten Energieübertragung von CpcL-PBS auf PSI und seine Rolle bei der Bildung des NDH-PBS-PSI-Superkomplexes zu verstehen, bestimmen wir die Kryo-EM-Strukturen von CpcL-PBS mit einem angehängten FNR aus Synechocystis 6803. Kombiniert mit Pikosekundenspektroskopie Anhand dieser Beweise enthüllt unsere Studie die Natur des endemitterähnlichen rotverschobenen Bilins und gibt Aufschluss darüber, wie CpcL-PBS in Abwesenheit eines PBS-Kerns Lichtenergie innerhalb von PBS und zu PSI effektiv übertragen könnte.

CpcL-PBS wurde aus einem Stamm von Synechocystis 6803 hergestellt, dem die Gene von apcAB24 fehlten, und das gereinigte CpcL-PBS wurde spektroskopisch und biochemisch auf seine Zusammensetzung und funktionelle Integrität analysiert (ergänzende Abbildung 1). Eine SDS-PAGE-Analyse mit anschließender Protein-N-terminaler Sequenzierung ergab, dass gereinigtes CpcL-PBS Phycocyanin (PC) und Linkerproteine, einschließlich CpcA, CpcB, CpcC1, CpcC2 und CpcL, enthielt. Das CpcL-PBS-Präparat enthält auch das Dreidomänen-FNR mit einer Molekülmasse von 45 kDa (ergänzende Abbildung 1e). Das Absorptionsspektrum des isolierten CpcL-PBS weist eine maximale Absorption bei 620 nm auf (ergänzende Abbildung 1g), typisch für eine Phycocyanin-Absorption. Sein Fluoreszenzemissionsspektrum weist bei Raumtemperatur zwei Peaks auf, einen bei 648 nm und einen bei 668 nm, wie zuvor berichtet24,25. Der Emissionspeak bei 648 nm ähnelt dem Phycocyanin-Hexamer mit einem CpcG-Linker , während der Emissionspeak bei 668 nm von Phycocyanin (PC) bei anderen PC-Trimeren oder Stäben nicht beobachtet wurde (ergänzende Abbildung 1g). Bei 77 K wird ein Hauptemissionspeak bei 670 nm beobachtet (ergänzende Abbildung 1h). Die Analyse der CpcL-PBS-Probe mit negativer Elektronenmikroskopie (EM) zeigt, dass sie stäbchenförmige Strukturen enthält und die Mehrzahl der Stäbchen drei Hexamere enthält. Es wurden auch einige Partikel mit mehr als drei αβ-Hexameren gefunden (ergänzende Abbildung 1f), was darauf hinweist, dass CpcL-PBS-Komplexe heterogener Natur sind, was mit einer früheren Arbeit 24 übereinstimmt. Um die Zerlegung des PBS-Komplexes während der Kryogittervorbereitung zu minimieren, wurden die Proben mit 0,012 % Glutaraldehyd behandelt und die Partikel von CpcL-PBS automatisch ausgewählt und klassifiziert (ergänzende Abbildung 2). Es wurde eine 2,6-Å-Dichtekarte von CpcL-PBS mit drei Schichten Hexameren erhalten, die es uns ermöglichte, Atommodelle für alle Chromophore (Biline) und Proteinketten zu erstellen (ergänzende Abbildung 3a – d). Bemerkenswert ist, dass die dreischichtige Architektur die dominierende Art war, da 2D- und 3D-Klassifizierungen andere Populationen nicht bereichern konnten. Dieser dreischichtige CpcL-PBS-Komplex ist 160 Å lang und 100 Å im Durchmesser (Abb. 1a – c). Der Komplex enthält 40 Untereinheiten, darunter 18 PC-αβ-Monomere (CpcA-CpcB-Heterodimer) und drei Linkerproteine, CpcL, CpcC1 und CpcC2, in einer 1:1:1-Stöchiometrie (Abb. 1d, e). Die CpcD-Domäne des FNR3D konnte am distalen Ende des CpcL-PBS eindeutig identifiziert werden (Abb. 1d, e). Die vier Linker sind in der Reihenfolge CpcL-CpcC1-CpcC2-CpcD (von FNR3D) nahezu linear organisiert, wobei CpcL nahe der Thylakoidmembran und FNR3D am distalen Ende liegt (Abb. 1d, e). CpcL-PBS ähnelt stark dem Stab von CpcG-PBS aus Synechocystis 680313 mit einem RMSD von 0,4 Å dazwischen (Abb. 1f). Diese Linker bilden ein Linkerskelett, das die CpcL-PBS-Assemblierung und deren Assoziation mit PSI unterstützt (Abb. 1g).

a–c Seitenansicht (a), Unteransicht (b) bzw. Draufsicht (c) des CpcL-PBS. α-PC, β-PC, CpcL, CpcC2 und die CpcD-Domäne von FNR sind jeweils in den Farben Pflaume, Kornblumenblau, Waldgrün, Cyan und Orange bemalt. d Die Anordnung der Linkerproteine (in Banddarstellung) innerhalb von CpcL-PBS. Von unten nach oben: CpcL, CpcC1, CpcC2 und die CpcD-Domäne von FNR. CpcC1 ist in Magenta und das andere Farbschema ist dasselbe wie in (a–c). e Wie (d), außer dass die Linkerproteine in Auffülldarstellung vorliegen und kein PC-Hintergrund vorhanden ist. f Strukturvergleich von CpcG-Stab (PDB 7SC8)13 und CpcL-PBS. g Schematische Darstellung von CpcL-PBS und PSI in der Thylakoidmembran mit den PC-Hexameren in Blau und dem PSI-Komplex in Waldgrün. Die beiden Domänen, die die zentralen Hohlräume der Hexamer besetzen: Pfam00427 (vertikale Rechtecke) und Pfam01383 (horizontale Rechtecke). PC-Trimere sind von unten nach oben fortlaufend nummeriert.

Die Pfam00427-Domäne von CpcL befand sich im Hohlraum des unteren Hexamers von CpcL-PBS, dem membrannahen Hexamer. Die Transmembranregion von CpcL, von der vorhergesagt wurde, dass sie CpcL-PBS an den Thylakoidmembranen verankert15, wurde wahrscheinlich aufgrund ihrer uneingeschränkten Bewegung in den gereinigten Komplexen nicht aufgelöst. Wie CpcC-Proteine in Rotalgen9,10 und anderen Cyanobakterien11,12,13 haben sowohl CpcC1 als auch CpcC2 von Synechocystis 6803 zwei Strukturdomänen, Pfam00427 am N-Terminus und Pfam01383 am C-Terminus. Die Pfam01383-Domäne von CpcC1 interagiert mit Pfam00427-Domänen von CpcL, während die Pfam01383-Domäne von CpcC2 mit Pfam00427-Domänen von CpcC1 interagiert. Die Bindung von CpcC1 an CpcL wird durch eine ausgedehnte Schnittstelle vermittelt, die die lange N-terminale Schleife (G219-G233, LoopC1), die Schleife zwischen β1 und β2 (I253-K259, Loop12) und die Helix 9 (α9) von umfasst die Pfam01383-Domäne von CpcC1. Diese beiden Schleifen falten sich in Richtung CpcL und interagieren von zwei gegenüberliegenden Seiten. Diese enge Schnittstelle wird durch eine große Anzahl von Resten von CpcC1 und CpcL vermittelt, einschließlich polarer und hydrophober Seitenketten (Abb. 2a, b). Die Sequenzausrichtung von CpcC1 und CpcC2 zeigt, dass die Gesamtsequenzen der beiden Proteine zwar einander sehr ähnlich sind, einige an den Wechselwirkungen mit CpcL beteiligte Reste von CpcC1 jedoch in CpcC2 nicht konserviert sind (ergänzende Abbildung 4a). Die Überlagerung der Pfam01383-Domänen von CpcC1 und CpcC2 (Abb. 2b) zeigt, dass CpcC1 aufgrund ihrer unterschiedlichen Konformationen in den beiden oben genannten Schleifenregionen eine optimalere Wechselwirkung mit CpcL als CpcC2 haben könnte. Tatsächlich zeigt der Sequenzvergleich, dass CpcC1 einen längeren Domänenlinker (16 Reste mehr) aufweist als CpcC2, der sich vor einer der mit CpcL interagierenden Schleifen befindet (ergänzende Abbildung 4a). Dieser paraloge Unterschied sollte auch zur Bevorzugung von CpcL gegenüber CpcC1 beitragen. In der CpcL-PBS-Struktur ist die Wechselwirkung der Pfam01383-Domäne von CpcC2 mit der Pfam00427-Domäne von CpcC1 in CpcL-PBS dieselbe wie die in den peripheren Stäbchen von CpcG-PBS11,12,13. Strukturell sind die beiden Domänen von CpcC2 aufgrund eines kürzeren Interdomänenlinkers anders ausgerichtet als die von CpcC1: Die Pfam01383-Domäne in CpcC2 weist eine Drehung um 250 ° auf (ergänzende Abbildung 4b), was zu einer leichten Abweichung führt -axiale Position des mittleren Hexamers von CpcL-PBS (Abb. 1a).

a Interaktion von CpcC1 (Magenta) mit CpcL (Waldgrün). Die Unteransicht von CpcC1 (oberes Bild) und die Draufsicht von CpcL (unteres Bild) zeigen die räumliche Verteilung der Reste, die an den hydrophoben Wechselwirkungen und der Wasserstoffbrückenbindung beteiligt sind. LoopC1: die Schleife nahe β1 von CpcC1. Schleife12: die Schleife zwischen β1 und β2 von CpcC1. b Detaillierte Wechselwirkungen zwischen CpcC1 (Magenta) und CpcL (Waldgrün), wobei der gleiche Bereich von CpcC2 (Cyan) über CpcC1 liegt. Das untere Panel zeigt die gleichen Strukturen wie das obere Panel mit einer 180-Grad-Drehung. c Gesamtinteraktion der Pfam01383 (CpcD)-Domäne von FNR (orange) mit der Pfam00427-Domäne von CpcC2 (cyan). d Der Schnittstellenbereich von CpcC2 mit den relevanten Resten dargestellt. e–g Drei repräsentative Bereiche der Wechselwirkungen zwischen der CpcD-Domäne von FNR und Pfam00427 von CpcC2. Die Abstände sind in Angström angegeben.

Am membrandistalen Ende von CpcL-PBS ist die CpcD-Domäne von FNR3D eindeutig identifiziert und interagiert mit dem Pfam00427 von CpcC2 hauptsächlich durch polare Wechselwirkungen (Abb. 2c – g). Diese strukturelle Grundlage der Bindung der CpcD-Domäne von FNR3D an die Pfam00427-Domäne eines CpcC-Proteins in einem PC-Hexamer ist wichtig für unser Verständnis der Rolle von CpcL-PBS bei der Bildung von NDH-PSI-PBS-Superkomplexen und im zyklischen Elektronenfluss28,29, 30,31. Die Strukturen der anderen beiden Domänen von FNR3D im CpcL-PBS konnten aufgrund der langen flexiblen Linkerregion zwischen Domänen nicht bestimmt werden21,22. Wir stellten fest, dass das CpcD-Protein, das sich an den distalen Enden der peripheren Stäbe des CpcG-PBS von Synechocystis 680313 befindet, und die CpcD-Domäne von FNR3D ein ähnliches Bindungsmuster wie die Pfam00427-Domäne von CpcC2 aufweisen (ergänzende Abbildung 5). Daher sind weitere Untersuchungen erforderlich, um zu verstehen, warum an den peripheren Stäben der Kryo-EM-Strukturen von CpcG-PBS kein FNR3D beobachtet wird.

Die Gesamtverteilung der Biline in CpcL-PBS entspricht der eines peripheren Stäbchens in CpcG-PBS11,12 (Abb. 3a) und die Biline stehen in engem Kontakt mit Linkerproteinen (Abb. 3b). Es wurde vermutet, dass die Protein-Bilin-Wechselwirkung eine entscheidende Rolle bei der unidirektionalen Energieübertragung innerhalb der Stäbchen von CpcG-PBS11 spielt, die Bilin-Konformationen in den Stäbchen in intaktem PBS wurden jedoch bisher nicht sorgfältig untersucht. Da das hier und von Liu et al.24 beschriebene CpcL-PBS einen Fluoreszenzemissionspeak bei Raumtemperatur bei 668 nm aufweist, der erheblich rotverschoben ist als der von allen CpcG-bezogenen PC-Stäben26,27, bietet es ein hervorragendes System zum Verständnis der strukturelle Mechanismus der Energieübertragung innerhalb von PBS-Stäben und zu PSI. Die hohe Auflösung der Kryo-EM-CpcL-PBS-Struktur ermöglicht es uns, die durch Protein-Bilin-Wechselwirkungen hervorgerufenen Bilin-Konformationsänderungen zu vergleichen, die im terminalen Emitter ApcD32 und den Phycobiliproteinen von an fernes rotes Licht angepassten Spezies33 beobachtet wurden.

a Gesamtverteilung der Biline in CpcL-PBS, wobei die Biline 1Iβ821, 1Iβ822, 1Iβ823 und 1IIβ821 rosa hervorgehoben sind. b Die räumliche Beziehung zwischen den Linkerproteinen (CpcL und CpcC1) und den hervorgehobenen Bilinen in Quadraten. c Die Konformation der Biline von CpcL-PBS oder CpcG-PBS von Synechocystis 6803. Von oben nach unten: 1Iβ821, 1Iβ822, 1Iβ823 und 2IIβ823 von CpcL, 1Iβ821G (G zeigt an, dass das Bilin von CpcG-PBS stammt) und 1Iβ822G des peripheren Stabs1 und das Bilin α84 des terminalen Emitters ApcD des CpcG-PBS-Kerns. Die Koordinaten der Biline aus CpcG-PBS von Synechocystis 6803 stammen aus einer aktuellen Kryo-EM-Studie13. d Schematische Darstellung der Biline der Ringe A bis D in Tafel (c). Dargestellt sind die Winkel zwischen den benachbarten Pyrrolebenen.

Alle Biline in CpcL-PBS sind Phycocyaninbilin (PCB), ein offenkettiges Tetrapyrrol, das kovalent an PC am Ring A gebunden ist. Die Konformation eines Bilins wird durch die Ebenen seiner vier Pyrrolringe und die drei Winkel zwischen den Ringen definiert. Sieben verschiedene repräsentative Biline, vier aus CpcL-PBS und drei aus CpcG-PBS, werden zum Konformationsvergleich zusammengestellt (Abb. 3c, d und ergänzende Abb. 3e – h). Die meisten Biline in CpcL-PBS haben eine Konformation wie das Bilin 2IIβ823 (Abb. 3c, d und ergänzende Abb. 3h): Der Winkel zwischen den Ringen A und B liegt zwischen 26 ° und 30 °; der Winkel zwischen den Ringen B und C kleiner als 10° ist; der Winkel zwischen den Ringen C und D größer als 35° ist. Für die drei β82-Biline im unteren Trimer von CpcL-PBS unterscheiden sich die Konformationen von denen von 2IIβ823: Die Winkel zwischen den Ringen C und D sind deutlich verringert, was darauf hindeutet, dass die Planarität dieser Biline stark verbessert ist. Da sich der Ring A in diesen drei Bilinen in der Nähe ihres β-PC und entfernt von CpcL-Resten befindet, bleiben die Winkel zwischen Ring A und Ring B nahezu unverändert. Das am stärksten abgeflachte Bilin in CpcL-PBS ist 1Iβ822. Seine Winkel zwischen den Ringen A und B, B und C sowie C und D betragen 26°, 7° bzw. 8° (Abb. 3c, d und ergänzende Abb. 3f). Der terminale Emitter ApcD hat einen Fluoreszenzemissionspeak bei 680 nm und seine Ringe B, C und D sind nahezu koplanar mit den drei jeweiligen Winkeln von 25°, 7° bzw. 2°32 (Abb. 3c, d). Daher wird erwartet, dass das Bilin 1Iβ822 eine signifikante Rotverschiebung der Absorptions- und Fluoreszenzemissionspeaks aufweist. Die Biline 1Iβ821 und 1Iβ823 sind kleiner, aber immer noch deutlich abgeflacht, und die Winkel zwischen den Ringen C und D betragen 21° in 1Iβ821 und 25° in 1Iβ823. Da das Bilin 1Iβ821 eine umfassende Wechselwirkung mit CpcL aufweist (Abb. 3b), ist eine signifikante Rotverschiebung der Absorption und Fluoreszenzemission zu erwarten. Die hier gemeldeten abgeflachten Bilins sind nicht auf CpcL-PBS beschränkt. Das Bilin 1Iβ821G („G“ für CpcG) aus dem peripheren Stab von Synechocystis CpcG-PBS, das dem Bilin 1Iβ821 von CpcL-PBS entspricht, weist die drei entsprechenden Winkel von 30°, 11° und 15° auf, die sehr ähnlich sind zu dem des Bilins 1Iβ821 von CpcL-PBS (Abb. 3d und ergänzende Abb. 3e). Das Bilin 1Iβ822G, das in seiner Position dem Bilin 1Iβ822 entspricht, weist die drei jeweiligen Winkel von 32°, 10° und 20° auf und ist deutlich weniger abgeflacht als 1Iβ822 von CpcL-PBS (Abb. 3c, d). Das Bilin 1Iβ821G von CpcG-PBS ist wahrscheinlich die Energiefalle der peripheren Stäbe für die Energieübertragung von den Stäben auf den Kern11, während 1Iβ822 von CpcL-PBS ein Kandidat für die Energiefalle für die Energieübertragung von CpcL-PBS auf PSI ist.

Jedes αβ-Monomer von CpcL-PBS verfügt über drei kovalent gebundene Chromophore, eines an der α-Untereinheit (α84) und zwei an β-Untereinheiten (β82 und β152), ähnlich den PC-αβ-Monomeren der peripheren Stäbe von CpcG-PBS4. CpcL befindet sich im Zentrum des PC-Hexamers in der Nähe der Thylakoidmembran, befindet sich in der Nähe von vier Bilinen und interagiert intensiv mit den drei unteren β82-Bilinen (1Iβ821, 1Iβ822 und 1Iβ823) (Abb. 3b). Spektroskopische Studien haben gezeigt, dass die β82-Biline, die sich im Inneren der PC-Trimerringe befinden, als Akzeptoren von Exzitonen fungieren, während die anderen beiden Biline eines PC-Trimers als Donoren fungieren4. Wenn PC-Trimere mit Hilfe von Linkerproteinen, insbesondere dem CpcG-Linker, PBS-Stäbe bilden, ist die Fluoreszenzemission rotverschoben26,27, was darauf hindeutet, dass die Linker den Energiezustand von Bilinen modulieren könnten. Kryo-EM-Strukturen von cyanobakteriellem CpcG-PBS zeigen, dass der CpcG-Linker aromatische Reste rund um das Bilin 1Iβ821 bereitstellt, das absorbierte Lichtenergie von Stäben auf PBS-Kerne überträgt11.

Ein Vergleich der umgebenden Reste des 1Iβ821-Bilins aus CpcG-PBS-Stab und CpcL-PBS zeigt, dass mehr Wechselwirkungen zwischen dem Bilin 1Iβ821 und CpcL beobachtet werden konnten als zwischen dem Bilin 1Iβ821G und CpcG (Abb. 4a, b und ergänzende Abb. 6a). ) und die Wechselwirkungen des Bilins 1Iβ821 mit CpcG und CpcL unterscheiden sich geringfügig, insbesondere in der Nähe von Ring D (ergänzende Abbildung 6a). Die Sequenzausrichtung zeigt auch die Divergenz der Reste um Ring D, wie Q57 und R178 von CpcL (ergänzende Abbildung 6d). Drei positiv geladene Argininreste (R178, R112 und R181) von CpcL befinden sich innerhalb von 4 Å vom Bilin 1Iβ821 (Abb. 4b und ergänzende Abb. 6a) und interagieren entweder mit den Carbonsäuregruppen an den Ringen B und C oder dem Sauerstoff am Ring D. Darüber hinaus sind N55, Q57, Q58 und Y182 in der Lage, Wasserstoffbrückenbindungen entweder mit den Stickstoff- oder Sauerstoffatomen von 1Iβ821 zu bilden (Abb. 4b und ergänzende Abb. 6a, 7a). Die Wechselwirkung zwischen Bilin 1Iβ823 und CpcL ist ebenfalls umfangreich und umfasst drei Argininreste (R16, R163 und R169) (Abb. 4c und ergänzende Abb. 6b, 7c). Im Gegensatz dazu beinhalten die Wechselwirkungen zwischen CpcL und 1Iβ822 keine Argininreste (Abb. 4d und ergänzende Abb. 6c, 7b). Die Reste von CpcG, die mit 1Iβ822 und 1Iβ823 interagieren, sind in CpcL hoch konserviert oder invariant (ergänzende Abbildung 6b, c).

a–d Unteransicht von CpcL-PBS mit CpcL (grün) und den drei β82-Bilinen 1Iβ821 (Quadrat b), 1Iβ822 (Quadrat c) und 1Iβ822 (Quadrat d) von CpcL-PBS. Wechselwirkung wichtiger Aminosäurereste von CpcL (grün) mit 1Iβ821 (Panel b), 1Iβ822 (Panel c) und 1Iβ823 (Panel d). Die Biline (offenkettiges Tetrapyrrol) sind rosa, die vier Pyrrolringe sind mit A bis D gekennzeichnet. Sauerstoffatome sind rot, Stickstoffatome blau. Die gestrichelten Linien zeigen Wechselwirkungen an und die Abstände zwischen den Atomen sind in Angström angegeben. e Strukturvergleich von Bilin 1Iβ822 aus CpcG-PBS-Stab (PDB 7SC8)13 und CpcL-PBS. Die Ausrichtung erfolgte mit der CpcB-Untereinheit als Referenz, und der RMSD aller Nichtwasserstoffatome am Ring D beträgt 0,5 Å zwischen zwei Bilinen. f Strukturvergleich von CpcG-CpcB- (PDB 7SC8) und CpcL-CpcB-Komplexen durch Ausrichtung ihrer Untereinheit CpcB. Die Umgebung um Bilin 1Iβ822 ist in einem braunen, durchgezogenen Rechteck hervorgehoben. g Vergrößerte Ansicht der Umgebung um Bilin 1Iβ822. Der Unterschied zwischen CpcL und CpcG liegt in den α6- und α7-Helices. h Eine um 45° gedrehte Ansicht von (g). Der Abstand zwischen den Resten, die die Konformation ihres Bilins 1Iβ822 regulieren, ist rot hervorgehoben. i Reste, die für die Modulation der Konformation dieser α6-α7-Region verantwortlich sind.

Das CpcL-PBS hat die Fluoreszenzemissionspeaks bei 648 nm und 668 nm bei Raumtemperatur (ergänzende Abbildung 1g). Ersteres befindet sich an der gleichen Position isolierter PC-Stäbe mit Linkern, während letzteres im Vergleich dazu deutlich rotverschoben ist zu jeder PC-Fluoreszenzemission. Wie oben erwähnt, kann das Bilin 1Iβ822, aber nicht 1Iβ821 für die Rotverschiebung der Fluoreszenzemission verantwortlich sein, da das Bilin 1Iβ822 in CpcL-PBS am stärksten abgeflacht ist. Die Umgebung des von β-PC bereitgestellten Bilins 1Iβ822 ist in CpcG-PBS-Stäben und CpcL-PBS dieselbe (ergänzende Abbildung 7b), der Unterschied in der Bilin-Konformation (Abb. 3c, d) zwischen den Bilinen 1Iβ822 von CpcG-PBS und CpcL-PBS wird wahrscheinlich durch subtile Unterschiede in ihrer Umgebung erzeugt, die durch CpcG oder CpcL erzeugt werden. Interessanterweise sind Schlüsselreste, die an der Wechselwirkung der Biline 1Iβ822 mit CpcG und CpcL beteiligt sind, identisch (Abb. 4d und ergänzende Abb. 6c). Die Überlagerung der beiden Biline unter Verwendung der CpcB-Untereinheit als Referenz für die Ausrichtung zeigt einen RMSD von 0,5 Å für den Ring D der Biline und eine scheinbare Drehung für den Ring D (um ~10°) (Abb. 4e). Im Vergleich zu CpcG wurde bei CpcL kein signifikanter Unterschied beobachtet, mit Ausnahme einer Region mit zwei verbundenen Helices neben 1Iβ822 (α6 und α7) (Abb. 4f). Tatsächlich klemmen α6 von CpcG oder CpcL und α6 von CpcB das Bilin 1Iβ822 und sollten in der Lage sein, die Konformation von Ring D zu modulieren (Abb. 4g, h). In dieser Region besteht ein wichtiger Unterschied zwischen I129 von CpcL und I127 von CpcG. Beide Reste befinden sich in ihren jeweiligen PBS-Strukturen neben dem Ring D von 1Iβ822 (ergänzende Abbildung 7b), aber I129 von CpcL in CpcL-PBS weist im Vergleich zu I127 von CpcG im CpcG- eine ~0,6 Å-Verschiebung in Richtung Ring D auf. PBS (Abb. 4g, h). In dieser helikalen Windungsregion (W125-L141 von CpcG und W127-L143 von CpcL) unterscheiden sich einige Reste in der Identität zwischen CpcL und CpcG, einschließlich L136, P137 und F139 von CpcL (Abb. 4i und ergänzende Abb. 6d). Diese Reste befinden sich im Wendebereich der beiden Helices und ihre äquivalenten Positionen in CpcG sind Y134, Q135 bzw. L137 (Abb. 4i). Offenbar erzeugen diese Sequenzunterschiede (ergänzende Abbildung 6d), insbesondere ein Prolin P137 in CpcL, lokale Konformationsunterschiede, die sich auf die Orientierung von α6 auswirken, was wiederum die Konformation des Bilins 1Iβ822 moduliert. Daher schlagen wir vor, dass diese Schlüsselreste in CpcL für die räumliche Einschränkung des Bilins verantwortlich sind, was zu einer Drehung des Rings D und einer Verringerung des Winkels zwischen den Ringen C und D führt.

Das CpcL reicht bis in die obere Hälfte des unteren Hexamers von CpcL-PBS und interagiert mit den Bilinen in der zweiten Trimerschicht. Beispielsweise könnten S70 und Q71 von CpcL Wasserstoffbrückenbindungen mit Ring D bilden, während K73 Wasserstoffbrückenbindungen mit Ring C von 1IIβ821 bilden könnte (ergänzende Abbildung 8). Neben CpcL nehmen auch die Linkerproteine CpcC1, CpcC2 und die CpcD-Domäne von FNR an Wechselwirkungen mit Bilinen innerhalb von CpcL-PBS teil (ergänzende Abbildung 8), und diese Wechselwirkungen könnten für die Bilin-Stabilisierung und den Energietransfer wichtig sein.

Ultraschnelle Fluoreszenzspektroskopie wurde verwendet, um den Energietransfer innerhalb von CpcL-PBS von Synechocystis 680325 und den Energietransfer von CpcL-PBS zum PSI von Anabaena 712034 zu untersuchen. Beide Studien zeigten die Bedeutung der „roten PCB“-Spezies von CpcL-PBS für den Energietransfer . Um die Energieübertragungsdynamik, die Exzitonenmigration zwischen den Bilinen von CpcL-PBS und die Identität des roten PCB zu verstehen, wurde eine zeitaufgelöste transiente Absorptionsspektroskopie im Femtosekundenbereich mit intaktem CpcL-PBS durchgeführt (Abb. 5a – c). Im Versuchsaufbau zur transienten Absorption wurde die Anregungswellenlänge auf 590 nm mit einer Pulsdauer von 100 fs eingestellt. Die erfassten transienten Absorptionsspektren bei unterschiedlichen Zeitverzögerungen sind in Abb. 5a dargestellt. Sowohl das Bleichen im Grundzustand als auch die stimulierte Emission trugen zur negativen Absorption bei, während eine vorübergehende Absorption aufgrund des angeregten Zustands der Biline zu einer positiven Absorptionsänderung führte. Durch globale Analyse der Spektren werden vier Zerfallskomponenten mit unterschiedlichen Zeitkonstanten erhalten (Abb. 5b). Die schnelle Komponente P1 mit einer Abklingzeit von 3,6 ps weist eine Absorptionsbleiche bei 631 nm und einen positiven Absorptionspeak bei 671 nm auf; Die zweite schnelle Komponente P2 weist eine Absorptionsbleiche bei 637 nm und eine positive Absorption bei 675 nm auf. Die Komponenten RS und RL haben eine Zwischenabklingzeit von 200 ps und ihr Absorptionsbleichen liegt bei 644 nm bzw. 668 nm. Die langsame Komponente T mit einer Abklingzeit von >1200 ps weist eine Absorptionsbleichung bei 669 nm auf. Die Analyse der globalen Dynamik zeigt, dass die Energiemigration innerhalb von CpcL-PBS sequentiell und in einem Pikosekunden-Zeitbereich erfolgt (Abb. 5c):

Hier ist die Komponente T das rote PCB, das eine photoinduzierte Bleichung bei 669 nm und eine lange Abklingzeitkonstante aufweist.

a Femtosekunden-zeitaufgelöste transiente Absorptionsspektren zwischen 550 nm und 700 nm. Die Anregungswellenlänge ist auf 590 nm eingestellt und die Dauer des Anregungslaserpulses beträgt 100 fs. Sechs zeitaufgelöste Spektren von 100 fs, 1 ps, 10 ps, 20 ps, 200 ps und >1200 ps werden angezeigt. b Vier speziesassoziierte Absorptionsspektren (SAS) werden aus der globalen Analyse der transienten Absorptionsspektren erhalten: P1 (3,6 ps), P2 (40 ps), RS (200 ps), RL (200 ps) und T (> 1200 ps) und ihr Bleichen erfolgt bei 631 nm, 637 nm, 644 nm, 668 bzw. 669 nm. c Kinetik der vier entsprechenden artassoziierten Komponenten. d Dynamik-assoziierte Differenzfluoreszenzspektren (DAS) von CpcL-PBS, angeregt bei 565 nm; Die Fluoreszenz wird mit einer Streak-Kamera aufgezeichnet. e Speziesassoziierte Emissionsspektren (SAS) von CpcL-PBS. Die Spitzenwellenlängen jeder Komponente werden angezeigt. f Kinetik der drei entsprechenden artassoziierten Zerfallskomponenten.

Der Energietransfer von CpcL-PBS wird durch zeitaufgelöste Pikosekunden-Fluoreszenzspektroskopie weiter untersucht (Abb. 5d – f). Die Zeit-Wellenlängen-2D-Karten von bei 565 nm angeregtem CpcL-PBS wurden in verschiedenen Zeitbereichen erhalten (ergänzende Abbildung 9) und eine globale Analyse der erfassten zeitaufgelösten Fluoreszenzspektren wurde durchgeführt. Die zerfallsassoziierten Spektren (DAS) und die artenassoziierten Spektren (SAS) sind in Abb. 5d bzw. Abb. 5e dargestellt. Es wurden drei artassoziierte Spektren mit ihren jeweiligen Abklingzeitkonstanten von 101 ps, 401 ps und 1999 ps erhalten, und das SAS mit einer Zeitkonstante von 401 ps besteht aus zwei Komponenten, eine mit einem Peak bei 651 nm und die andere bei 669 nm. Die Dynamik dieser Komponenten bei der Energieübertragung (Abb. 5f) bestätigt das folgende Energieübertragungsschema:

Mit der Bestimmung der Kryo-EM-Struktur von CpcL-PBS und der Komponenten bei der Energieübertragung durch ultraschnelle Spektroskopie wird der Energieübertragungsprozess von einer regulären Leiterplatte zur „roten Leiterplatte“ innerhalb von CpcL-PBS abgeleitet. In Femtosekunden-zeitaufgelösten transienten Absorptionsspektren weist die am schnellsten zerfallende Komponente P1 einen Bleichpeak bei 631 nm auf und wird den Bilinen PCB α84 und β155 zugeordnet, da diese Biline kaum Wechselwirkungen mit Linkerproteinen haben und voraussichtlich die kürzeste Absorptionsbleiche aufweisen Wellenlängen. Die Komponente P2 hat einen Bleichpeak bei 637 nm und wird allen PCB β82 zugeordnet, mit Ausnahme der drei Biline, die sich am unteren PC-Trimer befinden. Diese Biline, die sich in den Hohlräumen der Hexamer befinden, interagieren mit den Linkerproteinen (Abb. 4 und ergänzende Abb. 7), und es wird erwartet, dass ihre Absorptionsbleiche eine Rotverschiebung aufweist 26, 27. Die Komponente RS wird dem Bilin 1Iβ823 zugeordnet, da sie eine erhöhte Planarität aufweist (Abb. 3) und mit CpcL interagiert (Abb. 4 und ergänzende Abb. 6). Die Komponenten RL und RS haben die gleiche Abklingkonstante von 200 ps, RL weist jedoch eine deutlich rotverschobene Absorptionsbleichung bei 668 nm auf. Das Bilin 1Iβ821 hat eine ähnlich erhöhte Planarität wie 1Iβ821G, interagiert jedoch stärker mit dem Linkerprotein als 1Iβ821G oder 1Iβ823 (Abb. 4 und ergänzende Abb. 6). Daher wird RL vorläufig 1Iβ821 zugeordnet. Da das Bilin 1Iβ822 die stärkste Planarität und die umfassendste Wechselwirkung mit CpcL aufweist, wird die Komponente T 1Iβ822, dem roten PCB von CpcL-PBS, zugeordnet. In Pikosekunden-Fluoreszenzspektren verschmolz die Fluoreszenzemission aller PCB mit Ausnahme der drei Biline 1Iβ82 als Spektrum von C645 nm (100 ps); die Biline 1Iβ823(RS), 1Iβ821, (RL) führen zu den Spektren von C651nm/C669nm (401 ps); und das Bilin 1Iβ822 (T) ergeben das Spektrum von C672nm (1999 ps). Die Struktur und das zeitaufgelöste Fluoreszenzemissionsspektrum des Bilins 1Iβ822 (Komponente T) weisen besondere Merkmale von rotem PCB wie dem Bilin α84 in ApcD35 auf, was hier deutlich zeigt, dass CpcL-PBS strukturelle Merkmale für die Bildung eines terminalen Emitter- wie Red-PCB zur direkten Energieübertragung auf PSI. Unsere Studie beleuchtet auch die Energieübertragungsmechanismen in anderen Arten von PBS, die in Rotalgen und Cyanobakterien vorkommen, einschließlich Acaryochloris sp.36.

Der Wildtyp-Stamm von Synechocystis sp. PCC 6803 (Synechocystis 6803) und sein mutierter Stamm werden in BG11-Medium37 bei 25 °C mit einer Lichtintensität von 50 μmol Photonen m−2 s−1 gezüchtet. Das Medium für das Wachstum des Mutantenstamms wurde mit 10 μg ml–1 Erythromycin und 10 mM Glucose ergänzt. Die Kulturen wurden vorsichtig mit Luft plus 1 % CO2 durchperlt.

Der ΔapcAB-Mutantenstamm wurde mit einigen Modifikationen wie in Ajlani et al.38 beschrieben konstruiert. Die Upstream- und Downstream-Region des apcAB-Gens und ein DNA-Fragment, das für ein Erythromycin-resistentes Gen kodiert, wurden durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung der Primerpaare P1/P2, P3/P4 bzw. P5/P6 amplifiziert (Ergänzungstabelle 1). . Die obigen Sequenzen wurden durch Fusions-PCR ligiert. Die resultierenden PCR-Produkte wurden in den Wildtyp-Stamm Synechocystis 6803 transformiert. Die Segregation der ΔapcAB-Mutante wurde durch PCR verifiziert.

CpcL-PBS wurde aus dem ΔapcAB-Mutantenstamm gemäß Liu et al.24 oder mit einigen Modifikationen wie folgt isoliert. Alle Vorgänge wurden bei 22 °C durchgeführt. Kurz gesagt, die Zellen wurden in 0,75 M K/Na-PO4-Puffer bei pH 7,0 mit 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid aufgebrochen, indem sie dreimal durch eine French Press bei 7000 psi geleitet wurden. Nach 0,5-stündiger Inkubation mit 0,5 % n-Dodecyl-β-d-maltosid (DDM) (Gew./Vol.) wurden die Proben bei 20.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde sofort auf einen Saccharosegradienten geladen. Die Saccharosegradienten wurden aus Puffer A (0,75 M K/Na-PO4-Puffer, 0,0125 % Glutaraldehyd (Gew./Vol.), 0,03 % β-DDM (Gew./Vol.), pH 7,0) durch Zugabe von Saccharose zu diesen Konzentrationen hergestellt: 0,4, 0,55 , 0,7, 0,85, 1,0 und 1,5 M. Die Proben wurden 16 Stunden lang bei 370.000 × g unter Verwendung eines TLA110-Rotors auf einer Beckman Optima MAX-XP-Zentrifuge zentrifugiert. CpcL-PBS-Proben wurden an der Grenzfläche von 0,85 M bis 1,0 M Saccharose gesammelt. Die Saccharose aus gereinigten CpcL-PBS-Proben wurde durch Ultrafiltration mit 30 kD Millipore-Zentrifugalfiltern entfernt. Absorptionsspektren und Fluoreszenzemissionsspektren wurden wie zuvor beschrieben11 erhalten.

Vor der Vorbereitung von Gittern für Kryo-EM wurden CpcL-PBS-Proben auf ~0,75 mg ml−1 konzentriert. Aliquots (3,5 μl) der Proben wurden auf glimmentladene (20 s) löchrige Kohlenstofffilm-Kupfergitter (Quantifoil R1.2/1.3, +2 nm C-Membran, Cu 300 Mesh) geladen und 60 s gewartet. Anschließend wurden 3,5 μl Aliquot eines Puffers (50 mM Tris pH 7,0, 0,01 % β-DDM (Gew./Vol.)) zweimal zum Gitter gegeben und vor der Vitrifizierung sofort mit der Probe gemischt (um die hohe Konzentration an Phosphatsalzen zu verdünnen). Nach 2 s langem Blotting wurde das Gitter mit einem FEI Vitrobot Mark IV (18 °C und 100 % Luftfeuchtigkeit) in flüssiges Ethan getaucht. Kryo-Gitter wurden erstmals in einer Talos Arctica untersucht, die bei 200 kV betrieben wurde (ausgestattet mit einer FEI-CETA-Kamera). Gitter von guter Qualität wurden zur Datenerfassung auf einen FEI Titan Krios übertragen, der bei 300 kV mit dem Direktelektronendetektor Gatan BioQuantum GIF/K3 betrieben wurde.

Die Filme wurden mit einem BioQuantum GIF/K3-Direktelektronendetektor (Gatan) im Superauflösungsmodus bei einer Nennvergrößerung von 81.000 × und einer Belichtungsrate von 17,9 e−/Å2 pro Sekunde unter Verwendung der EPU 2-Software aufgenommen. Am Ende des Detektors wurde ein GIF-Quantenenergiefilter (Gatan) mit einer Spaltbreite von 20 eV verwendet. Der Defokusbereich wurde auf –1,0 bis –1,8 μm eingestellt. Die Gesamtbelichtungszeit betrug 3,84 s und es wurden 32 Bilder pro Bild mit einer Gesamtelektronenbelichtung von ∼60 e−/Å2 aufgenommen. Statistiken zur Datenerfassung sind in der Ergänzungstabelle 2 zusammengefasst.

Um die 3D-Struktur des CpcL-PBS-Komplexes zu bestimmen, wurden zwei Stapel von Filmstapeln aufgezeichnet. Rohe Filmbilder wurden von MotionCor239 ausgerichtet und in bewegungskorrigierte Summenbilder mit einer Pixelgröße von 1,07 Å gemittelt. Das Gctf-Programm (v1.06)40 wurde verwendet, um die Parameter der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) jedes bewegungskorrigierten Bildes zu schätzen. Die gesamte folgende Datenverarbeitung wurde mit Relion-3.141 durchgeführt. 1350 Partikel wurden manuell ausgewählt und einer 2D-Klassifizierung unterzogen, um Vorlagen für die automatische Partikelauswahl zu erstellen. Anschließend wurde eine automatische Auswahl der Bilder durchgeführt, die manuell zur Behandlung ausgewählt wurden. Die ausgewählten Partikel wurden einer Runde der 2D-Klassifizierung unterzogen und hochwertige Partikel wurden für die anschließende 3D-Klassifizierung weiter ausgewählt. Aus diesen Partikeln wurde ein erstes Modell erstellt. Nach mehreren Runden der 3D-Klassifizierung wurden relativ homogene Partikel für die 3D-Verfeinerung ausgewählt, was nach maskenbasierter Nachbearbeitung basierend auf den Goldstandard-Kriterien FSC 0,143 zu einer Karte mit einer Gesamtauflösung von 2,64 Å führte. Die Karte mit lokaler Auflösung wurde mit ResMap42 analysiert und mit UCSF Chimera43 angezeigt. Der Arbeitsablauf der Datenverarbeitung wurde in der ergänzenden Abbildung 2 dargestellt.

Die Kristallstruktur eines PC-αβ-Monomers aus Synechocystis 6803 (PDB-Code 4F0T)44 wurde als Ausgangsvorlage für die PC-Hexamer-Modellierung verwendet. Die Atommodelle von CpcL, CpcC1, CpcC2 und PetH wurden aus AlphaFold-Datenbanken übernommen45. Alle Strukturen wurden zunächst mithilfe der UCSF-Chimäre43 an die Dichtekarte angedockt und dann manuell in COOT46 angepasst. Die endgültigen Atommodelle wurden im realen Raum mit PHENIX47 unter Anwendung von Sekundärstruktur- und Geometriebeschränkungen verfeinert. Die endgültigen Atommodelle wurden mit Molprobity48 ausgewertet und die Statistiken zur Datenerfassung und Modellvalidierung wurden in die Ergänzungstabelle 2 aufgenommen.

Die Details des selbstgebauten ultraschnellen Absorptionsspektroskopieaufbaus wurden an anderer Stelle beschrieben49. Kurz gesagt lieferte ein Ti:Saphir-Laser (Hurricane, Spectra-Physics, USA) Impulse mit 100 fs (FWHM) bei einer zentralen Wellenlänge von 800 nm und einer Wiederholungsrate von 1 kHz. Anschließend wurden die Impulse mithilfe eines Strahlteilers in zwei Strahlen aufgeteilt: Einer wurde verwendet, um ein Superkontinuum-Weißlicht zu erzeugen, das als Sondenlicht verwendet wurde. Der andere wurde verwendet, um einen selbstgebauten nichtkollinearen optischen parametrischen Verstärker (NOPA) zu pumpen, um eine Anregungsquelle mit abstimmbarer Wellenlänge im sichtbaren Bereich zu erzeugen. Im aktuellen Experiment wurde die Anregungswellenlänge auf 590 nm eingestellt. Die Anregungsenergie betrug ca. 10 nJ pro Puls bei einer Punktgröße von ca. 120 μm. Die relative Polarisation der Pump- und Sondenimpulse wurde auf den magischen Winkel eingestellt. Die Probe wurde in eine 1 mm dicke Quarzglas-Durchflusszelle gegeben, um Probenschäden zu vermeiden. Die optische Dichte (OD) der Probe wurde bei ihrer maximalen Absorptionswellenlänge bei 620 nm auf 0,26 eingestellt. Die Zerfallskinetik wurde in einem frühen Stadium mit einer zeitlichen Auflösung von 0,02 ps pro Schritt gescannt, während in einem späteren Stadium verschiedene und größere Zeitverzögerungsschritte verwendet wurden. Die zeitaufgelösten Differenzabsorptionsspektraldaten wurden über 30 Mal gemittelt, um ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten.

Für die zeitaufgelösten Fluoreszenzmessungen wurde die Probe hierbei in eine 1 mm dicke Quarzglasküvette mit einer optischen Dichte von 0,24 bei 620 nm gegeben. Der Femtosekundenverstärker (Spectra Physics, USA) lieferte 100-fs-Impulse mit einer Wiederholungsrate von 5 kHz. Die Anregungswellenlänge wurde auf 565 nm von einem kommerziell erhältlichen abstimmbaren optischen parametrischen Verstärkungssystem (TOPAS, Spectra Physics) eingestellt, das vom Femtosekundenverstärker gepumpt wurde. Zur Anregung der Probe wurde eine Pulsenergie von 5 nJ pro Puls mit einer Punktgröße von ~200 μm verwendet. Um den restlichen Anregungsimpuls zu blockieren, wurde ein hochwertiger 600-nm-Langpassbandfilter verwendet. Das emittierte Fluoreszenzlicht wurde gesammelt und in einem Spektrographen fokussiert und mit einer Streak-Kamera 5200 (XIOPM, China) gemessen, die mit Abtastbereichen von 1,4 ns oder 5 ns und einer Zeitauflösung von ~30 ps bzw. ~200 ps arbeitet. Das vom CCD der Streak-Kamera aufgezeichnete Spektralfenster betrug bei den Messungen 260 nm und deckte die Fluoreszenzwellenlänge der Probe ab. Die zeitaufgelösten Fluoreszenzdaten wurden über 10 Einzelmessungen gemittelt.

Mithilfe einer globalen Anpassung wurden die einzelnen Spektralkomponenten aus dem überlasteten Spektrum aufgelöst. Das Programm wurde auf Basis von LabView implementiert. Wir verwendeten die Methode der Singularwertzerlegung (SVD) gemäß dem vorherigen Bericht49. DAS (Dynamics-Associated Different Spectra) ist ein kinetikabhängiges Differenzspektrum, das direkt durch globale Anpassung erhalten werden kann. Die speziesassoziierten Emissionsspektren (SAS) und die entsprechende Kinetik könnten durch die Erstellung eines Modells basierend auf dem Ergebnis von DAS aufgelöst werden, da SAS durch das von uns gewählte analytische Modell bestimmt wird. Hier haben wir zunächst die Lebensdauer jeder Komponente von DAS erhalten und dann jeden Prozess den entsprechenden Pigmenten zugeordnet, die am Energieübertragungsmodell beteiligt sind, basierend auf den in der Kryo-EM-Struktur aufgelösten Pigmentmolekülen:

Weitere Einzelheiten zur globalen Anpassung finden Sie in unseren früheren Veröffentlichungen50.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Daten, die diese Studie unterstützen, sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Die Atomkoordinate der CpcL-PBS-Struktur wurde bei Protein Data (PDB) mit dem folgenden Zugangscode 8HFQ (CpcL-PBS) hinterlegt. Die entsprechende Kryo-EM-Karte wurde bei der Electron Microscopy Data Bank (EMDB) unter der folgenden Zugangsnummer EMD-34724 (CpcL-PBS) hinterlegt. Auf die zuvor veröffentlichten Strukturen des Stäbchens von CpcG-PBS aus Synechocystis 6803 kann über den Zugangscode 7SC8 zugegriffen werden. Ergänzende Abb. 1e, f werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Zhang, L., Yang, J., Wang, L., Yang, G.-Z. & Weng, Y.-X. Direkte Beobachtung der Grenzflächenladungsrekombination zum angeregten Triplettzustand in all-trans-Retinsäure-sensibilisierten TiO2-Nanopartikeln durch zeitaufgelöste Femtosekunden-Differenzabsorptionsspektroskopie. J. Phys. Chem. B 107, 13688 (2003).

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Mao, P., Wang, Z., Dang, W. & Weng, Y. Mehrkanal-Lock-in-Verstärker unterstützte zeitaufgelöste Femtosekunden-Fluoreszenz-nichtkollineare optische parametrische Verstärkungsspektroskopie mit effizienter Unterdrückung des Superfluoreszenzhintergrunds. Rev. Sci. Instrument. 86, 123113 (2015).

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Referenzen herunterladen

Wir danken den Core Facilities der Peking University School of Life Sciences für ihre Unterstützung bei der Elektronenmikroskopie mit negativer Färbung. das Nationale Zentrum für Proteinwissenschaften der Universität Peking für Unterstützung bei der Probenvorbereitung; die Kryo-EM-Plattform und das Elektronenmikroskopielabor der Universität Peking für die Kryo-EM-Datenerfassung; Bitte wenden Sie sich an die High-Performance Computing Platform der Peking-Universität für Hilfe bei der Berechnung. Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation of China (22027802 an YW, 32070203 und 91851118 an JZ, 32270253 an ZGZ), dem chinesischen Ministerium für Wissenschaft und Technologie (2017YFA0503703 an JZ) und dem Qidong-SLS Innovation Fund an NG unterstützt

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Lvqin Zheng, Zhengdong Zhang, Hongrui Wang, Zhenggao Zheng.

School of Life Sciences, Universität Peking, Peking, 100871, China

Lvqin Zheng, Zhengdong Zhang, Hongrui Wang, Zhenggao Zheng, Chunxia Dong, Guopeng Wang, Ning Gao und Jindong Zhao

Staatliches Schlüssellabor für Membranbiologie, Universität Peking, Peking, 100871, China

Lvqin Zheng & Ning Gao

Staatliches Schlüssellabor für Protein- und Pflanzengenforschung, Universität Peking, Peking, 100871, China

Zhengdong Zhang, Hongrui Wang, Zhenggao Zheng, Chunxia Dong und Jindong Zhao

Labor für Physik weicher Materie, Institut für Physik, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Peking, 100190, China

Jiayu Wang, Heyuan Liu, Hailong Chen und Yuxiang Weng

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NG, YW und JZ konzipierten das Projekt und gestalteten das Experiment; ZDZ-, ZGZ- und CD-konstruierte Mutante; ZDZ, HW und ZGZ isolierten PBS und führten biochemische Analysen durch; LZ, ZDZ und ZGZ führten ein Kryo-EM-Experiment durch; LZ und GW führten Modellbildung zur Strukturbestimmung durch; JW, HL und HC führten eine ultraschnelle spektroskopische Analyse von PBS durch; LZ, ZGZ, NG, GW, YW und JZ analysierten und interpretierten Daten. LZ, NG, YW und JZ haben das Manuskript mit Hilfe aller Autoren geschrieben.

Korrespondenz mit Yuxiang Weng, Ning Gao oder Jindong Zhao.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Haijun Liu und Florent Waltz für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zheng, L., Zhang, Z., Wang, H. et al. Kryo-EM- und Femtosekundenspektroskopische Studien liefern mechanistische Einblicke in den Energietransfer in CpcL-Phycobilisomen. Nat Commun 14, 3961 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39689-7

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Eingegangen: 27. Januar 2023

Angenommen: 23. Juni 2023

Veröffentlicht: 05. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39689-7

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